干细胞诱导分化技术

干细胞诱导分化是干细胞研究中的一个重点。目前，干细胞可以定向诱导出成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、神经细胞、心肌细胞、血管内皮细胞等。而这些分化的细胞，将会有非常大的用途。比如，干细胞在组织支架中诱导成心肌细胞，可以长出一个功能完整的心脏，给那些需要更换心脏的人们使用。

人们通过不同的途径来实现诱导目的。目前主要包括:外源性生长因子诱导干细胞分化、转基因诱导干细胞分化、通过将干细胞与其他细胞共培养的方式诱导干细胞分化等。其中，添加外源因子诱导是目前研究的最多，成果最多的方式。

培养过程中添加或撤除某一种或某些细胞因子可指导干细胞的增殖或分化。目前在发育学方面研究比较深入的诱导因子主要有:维甲酸、骨形态发生蛋白、成纤维细胞生长因子、地塞米松、维生素c等。在各阶段添加的细胞因子不同，具体表现为细胞因子种类、浓度或组合的不同。

像成骨成脂肪成软骨方向的分化已经非常成熟，目前有成套的诱导液出售，如伟通生物的干细胞成骨成脂肪成软骨细胞诱导分化液。有效提高细胞诱导分化效率。另外附送鉴定染色液，并有详细操作步骤。

以下以人间充质干细胞成骨为例讲解基本的诱导条件和步骤：

成骨细胞诱导的准备

P₀-P₄代干细胞，针对P₀-P₄代MSC细胞进行成骨诱导分化可以获得更好的诱导效果。

培养箱：5％CO ²，37℃，饱和湿度条件下在空气中

容器：24孔板、96孔板或者6孔板

培养条件：避光贴壁培养;确保适当的气体交换

良好的细胞状态、合适的细胞融合度有助于成骨细胞的形成。

成骨诱导操作步骤：

1. MSCs按照5×10³/cm²接种于24孔培养板中，在干细胞扩增培养基37℃，5% CO2的无菌培养箱中培养24h~48h，观察MSC的生长状态，直至细胞融合度达到80%，细胞存活率90%以上。吸去培养基，

2. 更换为成骨诱导培养基，每3天更换一次培养基，连续诱导至3~4周。

3. 在经过特定时期的培养后，成骨培养后的细胞至4周时（26-28天）可以被von Kossa染色液染色骨结节鉴定晚期成骨或茜素红S染色（诱导超过21天后，见下面的方法）处理分析，以及可以进行基因表达分析和蛋白检测等。

★ 茜素红S染色分析

1. 经过21天或者更长时间的成骨分化培养后，去除培养基，用PBS清洗一次，然后再用4%的甲醛溶液固定细胞30 min，

2. 用PBS清洗2次，再用2%、pH4.2的茜素红S染色2~3min后，用PBS清洗3次，去处残留的染色液，

3. 在光学显微镜下进行显色观察分析。